Jokaisen PCR:n taustalla olevat periaatteet ovat samat riippumatta DNA-näytteestä.
PCR:n perustamiseen tarvitaan viisi ydin "ainesosaa". Selitämme tarkasti, mitä kukin näistä tekee, kun etenemme. Nämä ovat:
- kopioitava DNA-malli
- alukkeet, lyhyet DNA-osuudet, jotka käynnistävät PCR-reaktion ja jotka on suunniteltu sitoutumaan kopioitavan DNA-osan molemmille puolille
- DNA:n nukleotidiemäkset?(tunnetaan myös nimellä dNTP). DNA-emäkset (A, C, G ja T) ovat DNA:n rakennuspalikoita ja niitä tarvitaan uuden DNA-juosteen rakentamiseen.
- Taq-polymeraasientsyymi?lisätä uusia DNA-emäksiä
- puskurilla varmistaaksesi oikeat olosuhteet reaktiolle.
PCR sisältää lämmitys- ja jäähdytysprosessin, jota kutsutaan lämpökierrokseksi ja joka suoritetaan koneella.
On kolme päävaihetta:
- Denaturointi– kun kaksijuosteista templaatti-DNA:ta kuumennetaan sen erottamiseksi kahdeksi yksittäisjuosteeksi.
-
Hehkutus– kun lämpötilaa lasketaan, jotta DNA-alukkeet voivat kiinnittyä templaatti-DNA:han.
-
Laajentaminen– kun lämpötilaa nostetaan ja Taq-polymeraasientsyymi valmistaa uutta DNA-juostetta.
Nämä kolme vaihetta toistetaan 20-40 kertaa, jolloin DNA-kopioiden määrä kaksinkertaistuu joka kerta.
Täydellinen PCR-reaktio voidaan suorittaa muutamassa tunnissa tai jopa alle tunnissa tietyillä nopeilla koneilla.
Kun PCR on valmis, voidaan käyttää elektroforeesiksi kutsuttua menetelmää tuotettujen DNA-fragmenttien määrän ja koon tarkistamiseen.